Секвенцирањето на ДНК исто така зависи од нашата способност да се користи гел електрофореза за да се одделат низи од ДНК кои се разликуваат по големина со само еден базен пар.
Секвенција на ДНК
Во доцните 1970-ти, беа измислени две техники за секвенционирање на ДНК за подолги молекули на ДНК. Ова се методот на Сангер (или дидекси) и методот Максам-Гилберт (хемиски расцеп). Методот Максам-Гилберт е базиран на нуклеотид-специфично расцепување со хемикалии и најдобро се користи за секвенцијални олигонуклеотиди (кратки нуклеотидни полимери, обично помали од 50 базични парови во должина). Методот Сангер се почесто се користи бидејќи е докажано технички полесно да се примени, а со доаѓањето на ПЦР и автоматизирањето на техниката лесно се применува на долгите низи на ДНК, вклучувајќи и некои цели гени. Оваа техника се базира на прекин на синџирот со дидеоксинуклеотиди за време на реакциите на елигација на ПЦР.
Метод Sanger
Во методот Сангер, ДНК влакната што треба да се анализира се користи како шаблон и ДНК полимеразата се користи, во PCR реакција, за да се генерираат комплементарни нишки со користење на буквари.
Се подготвуваат четири различни реактивни мешавини на ПЦР, од кои секој содржи одреден процент на дидеоксинуклеозид трифосфат (ddNTP) аналози на еден од четирите нуклеотиди (ATP, CTP, GTP или TTP). Синтезата на новата низа на ДНК продолжува сè додека еден од овие аналози не се инкорпорира, тогаш времето е предвремено скратено.
Секоја PCR реакција ќе заврши со мешавина од различни должини на ДНК насоки, сите завршувајќи со нуклеотидот кој беше дидеокси етикетиран за таа реакција. Електрофорезата на гел потоа се користи за одвојување на насоките од четирите реакции, во четири одделни ленти и одредување на секвенцата на оригиналниот образец врз основа на тоа кои должини на нишки завршуваат со она што нуклеотид.
Во автоматската реакција на Сангер, се употребуваат буквари кои се обележани со четири различни обоени флуоресцентни ознаки. ПЦР реакции, во присуство на различни дидеокси нуклеотиди, се изведуваат како што е опишано погоре. Меѓутоа, потоа, четирите реактивни смеси потоа се комбинираат и се применуваат на една лента на гел. Бојата на секој фрагмент е откриена со помош на ласерски зрак и информациите се собираат од страна на компјутер кој генерира хроматограми кои покажуваат врвови за секоја боја, од кои може да се одреди матрицата ДНК секвенца.
Типично, методот на автоматски секвенционирање е точен само за секвенци до максимум од 700-800 базни парови во должина. Сепак, можно е да се добијат целосни секвенци на поголеми гени и, всушност, цели геноми, користејќи чекор-методи, како што се Primer Walking и Shotgun секвенционирање.
Во Primer Walking , работен дел од поголем ген се секвенира со помош на Sanger метод. Нови прајмери се генерираат од сигурен сегмент од секвенцата и се користат за продолжување на секвенционирање на дел од генот кој е надвор од опсегот на оригиналните реакции.
Секвенционирањето на дрога предизвикува случајно сечење на ДНК сегментот од интерес во посоодветни фрагменти со големина (податлив), секвенционирање на секој фрагмент и уредување на парчиња врз основа на преклопувачки секвенци. Оваа техника е олеснета со примена на компјутерски софтвер за уредување на преклопувачките парчиња.