Што ПЦР треба да прави со ДНК секвенирање и засилување на гените
Полимераза верижната реакција ( PCR ) е молекуларна генетска техника за правење повеќе копии на генот и исто така е дел од процесот на секвенционирање на гените.
Како дејствува реакцијата на веригата со полимерази?
Генските примероци се направени со помош на примерок од ДНК, а технологијата е доволно добра за да направи повеќе копии од една единствена копија од генот пронајден во примерокот. ПЦР амплификација на ген за да направи милиони копии, овозможува откривање и идентификација на генски секвенци со користење на визуелни техники засновани на големината и полнежот (+ или -) на парчето ДНК.
Во контролирани услови, мали сегменти на ДНК се генерирани од ензими познати како ДНК полимерази, кои додаваат комплементарни деоксинуклеотиди (dNTPs) до парче ДНК познато како "образец". Дури и помали парчиња ДНК, наречени "прајмери" се користат како појдовна точка за полимеразата. Грундираните се мали парчиња од ДНК (олигомери), кои обично се наоѓаат помеѓу 15 и 30 нуклеотиди. Тие се направени од знаејќи или погодување на кратки ДНК секвенци на самиот крај на ген се засилува. За време на ПЦР, ДНК што се секвенира се загрева и двојните навои се одвоени. По ладењето, грундираните се врзуваат за шаблонот (наречен annealing) и создаваат место за започнување на полимеразата.
Технологијата ПЦР
Полимераза верижната реакција (ПЦР) беше овозможена со откривање на термофили и термофилни полимеразни ензими (ензими кои го одржуваат структурниот интегритет и функционалност по загревањето на високи температури).
Чекорите вклучени во ПЦР техника се како што следува:
- Се создава мешавина, со оптимизирани концентрации на ДНК дефиниција, полимераза ензим, прајмери и dNTPs. Способноста за загревање на смесата без денатурирање на ензимот овозможува денатурирање на двојната спирала на примерок на ДНК на температури во опсег од 94 степени Целзиусови.
- По денатурацијата, примерокот се лади на поумерено ниво, околу 54 степени, што го олеснува алеалирањето (врзувањето) на прајмери со еднонамерен ДНК шаблони.
- Во третиот чекор од циклусот, примерокот се загрева до 72 степени, идеалната температура за Taq ДНК полимеразата, за издолжување. За време на елонгацијата, ДНК полимеразата го користи оригиналниот единствен синџир на ДНК како дефиниција за додавање на комплементарни dNTPs на 3 'краевите на секој прајмер и генерирање на дел од двостран верижна ДНК во регионот на генот од интерес.
- Групи кои се жалеа на ДНК секвенци кои не се точен спој не остануваат жигосани на 72 степени, со што се ограничува издолжување на генот од интерес.
Овој процес на denaturing, annealing и издолжување се повторуваат повеќе (30-40) пати, со што се зголемува експоненцијално бројот на копии од саканиот ген во смесата. Иако овој процес би бил доста досаден ако се изврши рачно, примероците може да се подготват и да се инкубираат во програмабилен Thermocycler, кој сега е вообичаен во повеќето молекуларни лаборатории, а комплетна ПЦР реакција може да се изведе за 3-4 часа.
Секој чекор за денатурирање го запира процесот на елонгација на претходниот циклус, со што се намалува новата нишка на ДНК и се одржува приближно до големината на посакуваниот ген.
Времетраењето на циклусот на елонгација може да се направи подолго или пократко во зависност од големината на генот од интерес, но на крајот, преку повторени циклуси на ПЦР, поголемиот дел од шаблоните ќе бидат ограничени само на големината на генот од интерес, бидејќи тие ќе бидат генерирани од производи на двете од грундираните.
Постојат неколку различни фактори за успешна ПЦР која може да се манипулира за да се подобрат резултатите. Најшироко користен метод за тестирање на присуството на PCR производ е електрофореза на агарозен гел . Која се користи за одделување на ДНК фрагменти врз основа на големината и полнежот. Потоа фрагментите се визуелизираат со користење на бои или радиоизотопи.
Еволуцијата
Од откривањето на ПЦР, биле откриени ДНК полимерази, различни од оригиналниот Taq. Некои од нив имаат подобра способност за "лекторирање" или се постабилни на повисоки температури, со што се подобрува специфичноста на ПЦР и се намалуваат грешките од вметнувањето на неточниот dNTP.
Некои варијации на ПЦР се дизајнирани за специфични апликации и редовно се користат во молекуларните генетски лаборатории. Некои од нив се ПЦР во реално време и ПЦР со обратна транскриптаза. Откривањето на ПЦР, исто така, доведе до развој на секвенционирање на ДНК, отпечатоци од ДНК и други молекуларни техники.