Прилагодувањата на било која од компонентите на реакцијата на полимераза во синџирот на реакција (PCR) може да го сменат квалитетот на исходот, или со подобрување или намалување на приносот и квалитетот на производот или со подобрување на специфичната реакција и чувствителност на реакцијата. Параметрите што влијаат на крајниот резултат можат да бидат или физички (т.е. температура, циклус пати) или хемиски (т.е. дефиниција концентрација, тип на ензимот што се користи). Следниве се неколку клучни фактори кои влијаат на успехот на ПЦР.
01 Чисти лабораториски услови
Бидејќи ПЦР е способен за откривање на единствена молекула на ДНК, важно е да се одржуваат чисти услови во лабораторијата. Секогаш носете свежи ракавици, користете стерилни стаклари, цевки и совети за пипета и стерилни раствори и чистење на работната површина пред да започнете со работа.
Секогаш вклучувајки контролни реакции, без дефиниција ДНК и без ензим, за да се обезбеди дека резултатите се навистина поради засилување на вистинскиот примерок.
Повеќето луѓе се осигуруваат дека имаат свои сопствени решенија кои не се споделуваат за да се олеснат проблемите со проблемите и назначените пипети често се резервирани само за ПЦР. ПЦР цевки без ДНаза и РНза, аспиратори од пипета што се отпорни на аеросол и кои работат во аспиратор со УВ светлина, исто така, се начини за минимизирање на проблемите.
02 Хемиски компоненти
- Имајте 18 до 24 бази
- Немаат секундарна структура (т.е. петелки)
- Урамнотежена дистрибуција на G / C и A / T парови
- Не се комплементарни едни со други на крајот на три метри
- Имаат температури на топење (Tm) околу 5-10 Целзиусови степени под температурата на затоплување, која обично е помеѓу 55 и 65 степени Целзиус
Tm за двете прајмери исто така треба да биде сличен за најдобри резултати.
03 Реакција Микс: Шаблон и прајмери
Оптималните концентрации на буквите се меѓу 0,1 и 0,6 микромоли / L. Количината на шаблонот варира во зависност од типот на ДНК (човечки, бактериски, плазмид).
Со многу ниски количини дефиниција, постојат и други стратегии за подобрување на резултатите, како што се зголемени броеви на циклуси или употреба на "топло стартување". Секогаш тестирајте нови прајмери со реакција на позитивна контрола, за да бидете сигурни дека тие работат под вашите специфични експериментални услови.
04 Реакција Микс: Ензимска активност
Концентрацијата на MgCl2 во реакционата мешавина може да влијае на исходот на ПЦР и може да игра важна улога во побрзи реакции. Магнезиумовиот катј формира растворливи комплекси со dNTPs за да се произведе вистинскиот супстрат што го препозна полимеразниот ензим.
Еднакви количини на сите четири dNTPs, исто така, помагаат да се намали стапката на грешка на полимеразата. Одредени адитиви како што се бетаин, БСА, детергенти, ДМСО, глицерол и пирофосфатаза, исто така, можат да влијаат на ензимската специфичност или ефикасноста на реакцијата.
05 Тип на термоциклер
Кога купувате лабораториска опрема, имајте на ум дека некои термоцикли се помалку прецизни од другите при одржување на точни, посакувани температури.
Ова е една област каде што евтиното нема да се исплати на долг рок кога ќе се соочи со финална реакција или со користење на прајмери кои бараат тесен опсег на температура на замрзнување.
Реакционните цевки со тенок ѕид дизајнирани да одговараат на прецизниот бренд на термоциклот кој го користите, исто така помагаат да се оптимизираат температурите на реакцијата.
06 Поставки на циклусот
Зголемениот принос може да се постигне со зголемување на времето за продолжување на секои 20 циклуси, за да се компензира помал ензим за да се засили повеќе дефиниција. Вообичаено, помалку од 40 циклуси се доволни за да се засилат помалку од 10 шаблони молекули до доволно голема концентрација за да се види агарозен гел обоени со етидиум бромид.