Клонирање на ген е чин на правење копии, или клонови, на еден ген. Откако ќе се идентификува ген, клоновите можат да се користат во многу области на биомедицински и индустриски истражувања. Генетскиот инженеринг е процес на клонирање на гените во нови организми или менување на ДНК секвенцата за промена на протеинскиот производ. Генетскиот инженеринг зависи од нашата способност да ги извршиме следните суштински процедури.
01 Полимераза синџирска реакција
02 Ензими за рестрикција
Откривањето на ензими познати како рестриктивни ендонуклеази е од суштинско значење за инженерството на протеини . Овие ензими ја намалуваат ДНК на специфични локации врз основа на нуклеотидната секвенца. Стотици различни рестрикциски ензими , способни за сечење на ДНК на посебна локација, се изолирани од многу различни видови на бактерии. ДНК скратена со ограничен ензим произведува многу помали фрагменти, со различни големини. Овие можат да се одвојат со помош на гел електрофореза или хроматографија.
03 електрофореза
Прочистувањето на ДНК од клеточна култура или неговото сечење со помош на рестрикционите ензими нема да биде од голема корист ако не можеме да ја визуелизираме ДНК - односно да пронајдеме начин да видиме дали вашиот екстракт содржи нешто или што ви недостасува го пресековме. Еден начин да го направите ова е гел електрофореза. Гели се користат за различни цели, од гледање на намалена ДНК за откривање на ДНК внесува и нокаути.
04 Приклучи се на две парчиња ДНК
Во генетските истражувања, често е неопходно да се поврзат две или повеќе одделни насоки на ДНК, да се создаде рекомбинантна влакно, или да се затвори кружна влакно што е ссечено со рестрикционите ензими. Ензимите наречени ДНК лигази можат да создадат ковалентни врски помеѓу нуклеотидни синџири. Ензимите ДНК полимераза I и полинуклеотид киназата исто така се важни во овој процес, за пополнување на празнините или фосфорилирање на 5 'завршува, соодветно.
05 Избор на мала самопроменет ДНК
Мали кружни парчиња на ДНК кои не се дел од бактериски геном, но се способни за само-репликација, се познати како плазмиди. Плазмидите често се користат како вектори за транспорт на гени помеѓу микроорганизми. Во биотехнологијата, откако ќе се засили ген од интерес, а и генот и плазмидот се намалуваат со рестрикционите ензими, тие се лигираат заедно генерирање на она што е познато како рекомбинантна ДНК. Вирусна (бактериофага) ДНК исто така може да се користи како вектор, како што може да космидите, рекомбинантни плазмиди кои содржат бактериофаген гени.
06 Метод за движење на вектор во клетка домаќин
Процесот на пренесување на генетскиот материјал на вектор како што е плазмид, во нови клетки домаќини, се нарекува трансформација. Оваа техника бара клетките домаќини да бидат изложени на промена на животната средина што ги прави "компетентни" или привремено пропустливи за векторот. Електроподавањето е една таква техника. Колку е поголем плазмидот, толку е помала ефикасноста со која се земаат клетките. Поголемите ДНК сегменти се полесно клонирани со користење на бактериофаг, ретровирус или други вирусни вектори или космици во метода наречена трансдукција. Фаг или вирусни вектори често се користат во регенеративната медицина, но може да предизвикаат вметнување на ДНК во делови од нашите хромозоми каде што не го сакаме, предизвикувајќи компликации, па дури и рак.
07 Методи за избор на трансгенски организми
Не сите клетки ќе ја преземат ДНК за време на трансформацијата. Од суштинско значење е да постои метод за откривање на оние што прават. Општо земено, плазмидите носат гени за отпорност на антибиотици и трансгенските клетки можат да бидат избрани врз основа на експресијата на тие гени и нивната способност да растат на медиуми кои го содржат тој антибиотик. Алтернативните методи на селекција зависат од присуството на други репортерски протеини, како што се x-gal / lacZ системот, или зелениот флуоресцентен протеин, што овозможува селекција базирана на боја и флуоресценција, соодветно.