Степенот на потребната чистота на протеини зависи од планираната крајна употреба на протеинот.
За некои апликации, сурова екстракт е доволна. Меѓутоа, за други намени, како што се во храната и фармацијата, потребно е високо ниво на чистота. За да се постигне ова, обично се користат неколку методи за прочистување на протеини, во серија чекори за прочистување.
Секој чекор за прочистување на протеините обично резултира со одреден степен на губење на производот. Затоа, идеална стратегија за прочистување на протеините е онаа во која се постигнува највисоко ниво на прочистување во најмалите чекори. Изборот на чекорите за употреба зависи од големината, полнежот, растворливоста и други својства на целниот протеин. Следните техники се најпогодни за прочистување на еден цитозолен протеин. Прочистувањето на комплексите на цитозолните протеини е посложено и обично бара различни методи да се применат.
Први чекори за прочистување на протеините
Првиот чекор во прочистувањето на интрацелуларните протеини (во внатрешноста на клетката) е подготовката на сурова екстракт .
Екстрактот ќе содржи комплексна мешавина на сите протеини од клеточната цитоплазма, како и некои дополнителни макромолекули, кофактори и хранливи материи. Суровата екстракт може да се користи за некои апликации во биотехнологијата, меѓутоа, ако чистотата е проблем, следните чекори за прочистување мора да се следат.
Екстрактите од сурови протеини се подготвуваат со отстранување на клеточни остатоци генерирани од клеточна лиза, која се постигнува со користење на хемикалии и ензими , sonication или француски печат. Остатоците се отстрануваат со центрифугирање, а супернатантот се обновува. Суровите препарати на екстрацелуларни протеини може да се добијат со едноставно отстранување на клетките со центрифугирање.
За одредени биотехнолошки апликации, постои побарувачка за термостабилни ензими : ензими кои можат да толерираат високи температури без денатурирање и притоа одржувајќи висока специфична активност. Организмите што ги произведуваат понекогаш се нарекуваат екстремофили. Лесен пристап кон прочистување на протеини отпорни на топлина е да се денатурираат другите протеини во смесата со загревање, а потоа ладењето на растворот (со што се овозможува репродукција на термостатскиот ензим или повторно да се раствори, ако е потребно.) Денатурираните протеини потоа може да се отстранат со центрифугирање.
Четири чекори за прочистување
Во минатото, заеднички втор чекор за прочистување на протеинот од суровата екстракт беше со врнежи во раствор со висока осмотска сила (т.е. сол раствори). Нуклеинските киселини во суровата екстракт може да се отстранат со преципитирачки агрегати формирани со стрептомицин сулфат или протамин сулфат.
Топењето на протеините обично се прави со користење на амониум сулфат како сол.
Различни протеини ќе преципитираат во различни концентрации на амониум сулфат . Општо земено, протеините со повисока молекуларна тежина талогуваат во пониски концентрации на амониум сулфат. Солта врнежи обично не доведуваат до високо прочистен протеин, но може да помогне во елиминирање на некои несакани протеини во мешавина и концентрирање на примерокот. Соли во растворот потоа се отстрануваат со дијализа преку порозна целулозна цевка, филтрација или хроматографија за исклучување на гел.
Современите биотехнички протоколи често ги користат многубројните комерцијално достапни комплети кои обезбедуваат решенија за стандардни постапки. Прочистувањето на протеините често се врши со користење на филтри и подготвени колони за гел филтрација. Се што треба да направите е да ги следите упатствата и да додадете вистински волумен на вистинското решение и почекајте одредено време додека го собирате елуантот (што излегува на другиот крај од колоната) во свежа цевка за тестирање.
- Методите на хроматографија може да се применат со помош на столбови со врвови или со автоматска ХПЛЦ опрема. Сепарацијата со HPLC може да се направи со обратна фаза, јонска размена или со исклучување на големина и примероци откриени со диодна низа или ласерска технологија. -
Протеински визуелизација и проценка на прочистување
- Хроматографијата со обратна фаза (RPC) ги одвојува протеините врз основа на нивните релативни хидрофобности . Оваа техника е високо селективна, но бара употреба на органски растворувачи. Некои протеини се перманентно денатурирани од растворувачи и ќе ја изгубат функционалноста за време на RPC. Затоа овој метод не се препорачува за сите апликации, особено ако е неопходно целниот протеин да ја задржи активноста.
- Јон-размена хроматографија се однесува на одвојување на протеините врз основа на полнење . Колоните можат да бидат подготвени за размена на анјони или размена на катјони. Колоните за размена на аниони содржат стационарна фаза со позитивен полнеж кој привлекува негативно наелектризирани протеини. Колони за размена на катјони се обратни, негативно наелектризирани монисти кои привлекуваат позитивно наелектризирани протеини. Елудирањето на целните протеини се врши со промена на pH во колоната, што резултира со промена или неутрализација на наелектризираните функционални групи на секој протеин.
- Хроматографијата со големина-исклучување ( гел филтрација ) ги одделува поголемите протеини од малите бидејќи поголемите молекули патуваат побрзо низ вкрстениот полимер во комората за хроматографија. Големите протеини не се вклопуваат во порите на полимерот, додека помалите протеини го прават, и подолго трае да патуваат низ комората за хроматографија, преку нивниот помалку директен пат. Елуатот се собира во серија на цевки кои ги одвојуваат протеините врз основа на времето на елуирање. Гел филтрација е корисна алатка за концентрирање на протеински примерок, бидејќи целните протеини се собираат во помал елуционен волумен отколку што првично беше додаден во колоната. Слични техники на филтрација може да се користат за производство на големи протеини поради нивната економичност.
- Афинитетната хроматографија е многу корисна техника за "полирање" или завршување на процесот на прочистување на протеините. Монилите во комората за хроматографија се вкрстени со лиганди кои се врзуваат специјално на целниот протеин. Протеинот потоа се отстранува од колоната со испирање со раствор кој содржи слободни лиганди. Овој метод дава најчисти резултати и највисока специфична активност во споредба со другите техники.
- SDS-PAGE е електроацереза на полиакриламид гел, која се изведува во присуство на SDS (натриум додецил сулфат), кој се врзува за протеините, давајќи им голем нето негативен полнеж. Бидејќи обвиненијата за сите протеини се прилично еднакви, овој метод ги дели речиси целосно врз основа на големината. SDS-PAGE често се користи за тестирање на чистотата на протеини по секој чекор во серијата. Како што несаканите протеини постепено се отстрануваат од мешавината, бројот на бендови визуелизирани на гел SDS-PAGE е намален, се додека не постои само еден бенд што го претставува саканиот протеин.
- Имуноблоттинг е техника на визуелизација на протеини применета во комбинација со афинитетна хроматографија. Антителата за специфичен протеин се користат како лиганди на афинитетната хроматографска колона. Целниот протеин се задржува на колоната, а потоа се отстранува со испирање на колоната со сол раствор или други агенси. Антителата поврзани со радиоактивни или етикети за боја помагаат при откривање на целните протеини откако ќе се одделат од остатокот од смесата.
Извори:
Zubay G. 1988. Биохемија, второ издание. Macmillan Publishing Co., Њујорк, Њујорк, САД.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Прирачник за прочистување на протеините, издание AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Њу Џерси, САД. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.